|
'''Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (ՊՇՌ)''' նուրբ մեթոդ է, որը կրկնահանում է ([[ամպլիֆիկացիա|ամպլիֆիկացնում է]]) [[ԴՆԹ]]-ն և թույլ է տալիս հայտնաբերել մեկ որոշակի առանձնահատուկ ԴՆԹ-ի մոլեկուլ միլիոնավոր ուրիշ մոլեկուլների առկայության դեպքում:դեպքում։
Մեթոդի էությունը կայանում է բազմակի ամպլիֆիկացիայի մեջ, որը իրականացվում է ԴՆԹ-ի որոշակի տեղմասերում փորձանոթների մեջ կրկնվող ջերմային ցիկլերի (բոլորապտւյտների) ընթացքում:ընթացքում։
Ամպլիֆիկացիայի յուրաքանչյուր [[ցիկլ|ցիկլում]]ում վաղաժամ սինթեզված հատվածները նորից կրկնահանվում են:են։ Դրա շնորհիվ տեղի է ունենում ԴՆԹ-ի առանձնահատուկ հատվածների քանակի բազմակի
ավելացում միլիարդավոր անգամ:անգամ։
ՊՇՌ մեթոդը հնարավորություն է տալիս արագ և նյութական [[ռեսուրս|ռեսուրսների]]ների և ժամանակի ոչ մեծ ծախսերով, ստանալ ավելի քան 10.000.000 որոշակի հաջորդականությամբ ԴՆԹ-ի կրկնօրինակներ, նախապես առաջարկված մեկ կամ մի քանի [[մոլեկուլ|մոլեկուլներով]]ներով:
== Պատմություն ==
Վերջին տասնամյակում [[մոլեկուլային կենսաբանություն|մոլեկուլային կենսաբանության]] բնագավառում ՊՇՌ-ի մեթոդի հայտնագործումը դարձել է առավել նշանավոր իրադարձություններից մեկը:մեկը։ 1983թ [[Քերրի Մյուլիս]]ը հայտնաբերեց ԴՆԹ-ի որոշակի տեղամասերի [[in vitro]] ամպլիֆիկացիայի մեթոդը պոլիմերազային ռեակցիայի կրկնվող ջերմային ցիկլերի ընթացքում: ընթացքում։ 1985թ այս մեթոդը առաջին անգամ օգտագործվեց գործնականում [[բետա-գլոբին]]ի [[գեն]]ի տեղամասի ամպլիֆիկացիայի համար [[ԴՆԹ պոլիմերազա|ԴՆԹ- պոլիմերազի]] մեծ հատվածի օգնությամբ ([[Կլենովի հատված]]):։ ՊՇՌ-ի լայն տարածումը սկսվեց 1988թ համահեղինակ [[Սայք]]ի հիմնական աշխատանքի հրատարակության պահից, որտեղ հեղինակները օգտագործել են [[թերմոֆիլ]]աների ԴՆԹ-պոլիմերազներ և դիտարկել են մեթոդի [[տեսական]] հիմքերը, այս հոտդածը 1988-89թթ դարձավ առավել մեջ բերվող, իսկ 1993թ Քերրի Մյուլիսին շնորհվեց [[նոբելյան մրցանակ]] ՊՇՌ մեթոդի հայտնագործման համար:համար։
ՊՇՌ-ի կազմակերպման համար խառնուրդի մեջ մտնող բաղադրիչների կազմը և [[պրայմերներ]]ի (ԴՆԹ-ի կարճ արհեստական սինթեզված մոլեկուլ) օգտագործման հիմնական սկզբունքները ԴՆԹ-ի կրկնօրինակը ստանալու համար առաջին անգամ նկարագրվել 1971 թ-ին Քլեփի կողմից:կողմից։ Սակայն, այն ժամանակ դեռևս դրսևորված չէր ՊՇՌ-ի հիմնական հատկանիշը` ԴՆԹ-ի սկզբնական հատվածի կրկնօրինակման քանակի աստիճանական ավելացումը, որպես արդյունք:արդյունք։
1983 թ-ին ՙCetus՚ ձեռնարկության աշխատակից Կերի Մյուլիսը առաջարկեց մի մեթոդ, որը հետագայում հայտնի դարձավ որպես պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա` ՊՇՌ:ՊՇռ։
Արժե նշել, որ այս հայտնագործմանը համընթաց ուղեկցում էր որոշ [[տեխնոլոգիա]]ների զարգացումը:զարգացումը։ Մասնավորապես այն սարքերի ի հայտ գալը, որոնք թույլ էին տալիս ավտոմատ սինթեզել ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածները ([[օլիգոնուկլեոտիդներ]]ը):։ Միևնույն ժամանակ հայտնաբերվեցին գեյզերներում ապրող եզակի [[միկրոօրգանիզմ]]ներ, որոնց [[ֆերմենտ]]ային համակարգը, մասնավորապես ԴնԹ-պոլիմերազը, բարձր ջերմաստիճաններում պահպանում է իր [[կենսաբանական ակտիվությու]]նը ընդհուպ մինչև 95˚C, որը համարվում է անհրաժեշտ պայման պոլիմերացման շղթայական ռեակցիա անցկացնելու համար:համար։
ՊՇՌ-ի հայտնագործման արդյունքը դարձավ մեթոդի գրեթե անհապաղ [[գործնական]] կիրառումը:կիրառումը։ Այդ պահից հրատարակությունների քանակը, որոնցում հեղինակները հայտնում էին իրեց աշխատանքներում պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի կիրառման մասին, սկսեց աճել [[երկրաչափական պրոգրեսիա]]յով: Այս մեթոդը այնքան հանրամատչելի դարձավ, որ մոլեկուլյար կենսաբանության ոլորտում այսօր արդեն դժվար է պատկերացնել աշխատանք առանց դրա օգտագործման:օգտագործման։ ՊՇՌ-ի մեթոդի բուռն զարգացումը ստացվել է հատկապես շնորհիվ ՙ[[մարդու գենոմ]]՚ միջազգային ծրագրի:ծրագրի։ Ստեղծվեցին ժամանակակից [[լազերային տեխնոլոգիա]]ներ, որոնք վերծանում են ԴՆԹ-ի [[նուկլեոտիդային հաջորդականություն|նուկլեոտիդների]] հաջորդականությունը:հաջորդականությունը։ Եթե ոչ վաղ անցյալում 250 զույգ [[նուկլեոտիդ]]ների ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների վերծանման համար պահանջվում էր մեկ շաբաթ, ապա ժամանակակից լազերային [[սեկվենատոր]]ները թույլ են տալիս մեկ օրում որոշել մինձև 5000 զույգ նուկլեոտիդներ:նուկլեոտիդներ։ Սա իր հերթին նպաստում է ԴՆԹ-ի հաջորդականության մասին ինֆորմացիայի [[տվյալների բազա]]յի նշանակալից աճին:աճին։ Ներկայումս մշակվել են պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի բազմազան [[մոդիֆիկացիա]]ներ (վերափոխումներ), ցույց է տրված [[թեստ-համակարգ]]ի ստեղծման հնարավորությունը միկրօրգանիզմների, բույսերի տարբեր հիվանդությունների և դրանց նկատմամբ կայունության գեների, [[կետային մուտացիա]]ների հայտնաբերման համար, նկարագրված են մեթոդի տասնյակ տարբեր կիրառություններ:կիրառություններ։
== Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի սկզբունքները ==
ՊՇՌ-ն ԴնԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեթոդ է, որի միջոցով մի քանի ժամվա ընթացքում, միլիարդավոր անգամ կարելի է բազմապատկել (անջատել և շատացնել) ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն:հաջորդականություն։ Ունեցած ԴՆԹ-ի օրինակի հետազոտումը, զգալիորեն հստակեցնում է հսկայական քանակի կրկնօրինակ ստանալու հնարավորությունը, խիստ որոշակի գենոմի տեղամասից: տեղամասից։
== Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի բաղադրիչներ ==
ՊՇՌ անցկացնելու համար ռեակցիոն խառնուրդում պետք է առկա լինեն հետևյալ բաղադրիչները`
''[[Պրայմեր]]ներ'' - արհեստական սինթեզված օլիգոնուկլեոտիդներ, որպես կանոն 15-ից մինչև 30 զույգ նուկլեոտիդներ, նույնությամբ համապատասխանելի տեղամասի ԴՆԹ-ի նշանին:նշանին։ Նրանք կարևոր դեր են խաղում ամպլիֆիկացիայի իրականացման համար:համար։ Ճիշտ ընտրված պայմանները ապահովում են թեստ-համակարգի յուրահատկությունն ու զգայունությունը:զգայունությունը։
''[[Taq-պոլիմերազ]]'' - ջերմակայուն ֆերմենտ է, որը հնարավոր է դարձնում իրականացնել ԴՆԹ-ի –րդ շղթայի 3` ծայրի կառուցումը կոմպլեմենտարության սկզբունքի համաձայն :
''[[Դեզօքսինուկլեոտիդտրիֆոսֆատ]]ների խառնուրդ (դնՏՖ)'' - դեզօքսիադենոզինտրիֆոսֆատ (դԱՏՖ), դեզօքսիգուանոզինտրիֆոսֆատ (դԳՏՖ), դեզօքսիցինտրիֆոսֆատ (դՑՏՖ) և դեզօքսիտիմիդինտրֆոսֆատ (դՏՏՖ) -ՙշինարարական նյութ՚:
''Բուֆֆեր'' – [[կատիոն]]ների և [[անիոն]]ների որոշակի խտությամբ խառնուրդ:խառնուրդ։ Ապահովվում են փոխազդման համար լավագույն պայմանները, ինչպես նաև pH-ի կայուն արժեք:արժեք։
''Ուսումնասիրվող նմուշ'' – ԴՆԹ-ի մոլեկուլ է, որն ավելացվում է փոխազդող խառնուրդի մեջ, այն կարող է իր մեջ ամփոփել պահանջվող (որոնելի) ԴՆԹ-ի հատվածը:հատվածը։
== Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի փուլերը ==
Եթե ուսումնասիրվող նմուշում առկա է պահանջվող ԴՆԹ-ն, ապա ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում դրա հետ կատարվում են մի շարք փոփոխություններ, որոնք ապահովվում են որոշակի [[ջերմային ցիկ]]լերով: Ամպլիֆիկացիայի յուրաքանչյուր ցիկլ բաղկացած է 3 էտապից:էտապից։
=== [[Բնափոխում]] (դենատուրացիա): ===
Առաջին էտապում անհրաժեշտ է բնափոխել նմուշային ԴՆԹ-ն:ն։ Դրա համար փոխազդող խառնուրդը տաքացնում են մինչև 92-95˚C , որի արդյունքում ԴՆԹ-ի [[երկշղթայական մոլեկուլ]]ները բացվում են դառնալով երկու միաշղթայական մոլեկուլ:մոլեկուլ։
=== [[Շիկամշակում]]: ===
2-րդ էտապում պրայմերները միանում են միաշղթա ԴՆԹ-ի նշանին:նշանին։ Այս պրոցեսը կրում է ՙշիկամշակում՚ անվանումը, որը ծագում է անգլերեն ՙannealing՚ մետաղագործական տերմինից, որը նշանակում է որոշակի ռեժիմում ձուլվացքի սառեցումը:սառեցումը։
Պրայմերները ընտրում են այնպես, որ նրանք սահմանափակում են պահանջվող հատվածը և [[կոմպլիմենտարություն|կոմպլեմենտարորեն]] հակադիր են ԴՆԹ-ի շղթաներին:շղթաներին։ Շիկամշակում տեղի է ունենում [[Չարգաֆֆ]]ի կոմպլեմենտարության կանոնին համապատասխան, այսինքն` ԴՆԹ-ի երկշղթանի մոլեկուլում [[ադենին]]ի դիմաց միշտ գտնվում է [[թիմին]]ը, իսկ [[գուանին]]ի դիմաց ` [[ցիտոզին]]ը:Եթե այս սկզբունքը չի պահպանվում, ապա պրայմերների շիկամշակում տեղի չի ունենում: Պրայմերների շիկամշակումից հետո Taq – պոլիմերազը, սկսելով պրայմերի 3` ծայրից, կառուցում է ԴՆԹ-ի 2-րդ շղթան:շղթան։
=== [[Էլոնգացիա]] (սինթեզ): ===
3–րդ էտապում փոխազդող խառնուրդում ջերմաստիճանը հասցվում է մինչև Taq – պոլիմերազի աշխատանքի [[օպտիմում]]ը, հնարավոր է դառնում օգտագործել պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի երկփուլանի ցիկլը, համատեղելով երկու փուլերը` շիկամշակումը և էլոնգացիան մեկի մեջ: մեջ։
Հետագա փուլում շիկամշակումն ու էլոնգացիան բազմիցս կրկնվում են ( ավելի քան 30 անգամ):։ Յուրաքանչյուր ցիկլում ԴՆԹ-ի հատվածի սինթեզված կրկնօրինակի քանակը կրկնապատկվում է :
== Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի ցիկլային սինթեզի արդյունքը ==
ԴՆԹ-ի առանձին հատվածի քանակի աստիճանական մեծացում կարելի է արտահայտել հետևյալ բանաձևով`
A=M*(2n-n-1)~2n
որտեղ ` A-ամպլիֆիկացիայի համար պրայմերների քանակն է ,
M -ԴՆԹ-ի սկզբնական քանակը,
n - ամպլիֆիկացիայի ցիկլերի թիվը:
Փաստորեն, որոշ տվյալների հիման վրա, ամպլիֆիկացիայի առանձին ցիկլերի արդյունավետության աստիճանը կազմում է 78-97%: Այս արժեքը կարող է ավելի քիչ լինել այն դեպում, երբ փոխազդման խառնուրդում առկա լինեն [[ինհիբիտոր]]ներ: Այդ պատճառով, ամպլիֆիկացիայի արտադրանքի իրական քանակը ավելի լավ կնկարագրի հետևյալ հավասարումը`
A=M*(1+E)n
A=M*(1+E)n
որտեղ ` E - փոխազդման արդյունավետության արժեքն է:
Արժե նկատել, որ ամպլիֆիկացիայի ընթացքում նախնական շղթայի վրա սինթեզվում են նաև երկարավուն հատվածներ, այնուամենայնիվ, դրանց կուտակումը տեղի է ունենում միայն [[թվաբանական պրոգրեսիա]]յով հետևյալ բանաձևով `
K = M*n
որտեղ` K - ամպլիֆիկացիայի երկարավուն արտադրանքի քանակն է ,
n – ցիկլերի թիվը:թիվը։
Այսպիսով, առանձին հատվածները սահմանափակված պայմաններում առաջինն են հայտնվում 2-րդ ցիկլի վերջում, կուտակվում են երկրաչափական պրոգրեսիայով և շատ շուտով սկսում եմ գերակշռել ամպլիֆիկացիայի արտադրնքների թվում:թվում։
== Պլատոյի` ՙԲարձրահարթի էֆեկտը՚ ==
Նկատի առնենք, որ ամպլիֆիկացիայի պրոդուկտների կուտակման ընթացքը երկրաչափական պրոգրեսիայով ընթանում է միայն սահմանափակ ժամկետում, իսկ հետո դրա արդյունավետությունը բեկումնային ընկնում է:է։ Սա կապված է այսպես կոչված ՙբարձրահարթի՚ էֆեկտով:էֆեկտով։
Այս տերմինն օգտագործում են ամպլիֆիկացիայի վերջին ցիկլերում ՊՇՌ-ի պրոդուկտների կուտակման ընթացքը նկարագրելու համար, երբ ամպլիկոնների քանակը հասնում է 0,3-1 [[պմոլ|մոլ]]ի:
Կախված պայմաններից և ամպլիֆիկացիայի փոխազդման ցիկլերի քանակից, ՙբարձրահարթի՚ էֆեկտին հասնելու պահին ազդում են [[սուբստրատ]]ների (դնՏՖ-ի և պրայմերների) [[ուտիլիզացի]]ան (օգտագործումը), [[ռեակտանտ]]ների կայունությունը (դնՏՖ-ի և ֆերմենտի), ինհիբիտորների քանակը ներառյալ [[պիրոֆոսֆատ]]ները և ԴՆԹ-[[դուպլեքս]]ները, մրցակցությունը ոչ յուրահատուկ արտադրանքների ռեակտատների կամ պրայմեր-[[դիմերմեր]]ի համար, առանձնահատուկ արտադրանքի խտությունը և ոչ ամբողջական բնափոխումը ազդում են ամպլիֆիկացիայի արտադրանքների բարձր [[խտության|խտություն]] աստիճանի դեպքում:դեպքում։ Որքան փոքր է հետազոտվող ԴՆԹ-ի սկզբնական խտությունը, այնքան բարձր է փոխազդման ելքի ռիսկը դեպի ՙբարձրահարթի՚ էֆեկտը:էֆեկտը։ Այս պահը կարող է վրա հասնել մինչև այն, երբ ամպլիֆիկացիայի առանձնահատուկ արտադրանքի քանակը բավարար կլինի, որպեսզի հնարավոր դառնա վերլուծման ենթարկել դրանց: դրանց։ Միայն լավագույն թեստ-համակարգերն են թույլ տալիս խուսափել դրանից:դրանից։
== Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի կազմակերպման փուլերը ==
'''[[Կենսաբանական նյութ]]ի փորձարկման նախապատրաստությունը'''
Կախված առաջադրված խնդրից ԴՆԹ-ի անջատման համար օգտագործում են տարբեր մեթոդիկաներ:մեթոդիկաներ։ Դրանց էությունն է [[նմուշ]]ից ԴՆԹ-ի լուծազատումը (ստացումը) և հեռացումը կամ չեզոքացումը կողմնակի խառնուրդներից ԴՆԹ-ի մաքուր [[պատրաստուկ]] ստանալու համար, որը պիտանի է ՊՇՌ կազմակերպելու համար:համար։ Երբեմն բավական է լինում 5-10 րոպե լավ եռացնել, սակայն, մեծամասամբ պահանջվում է ավելի բարդ մեթոդներ:ԴՆԹմեթոդներ։ԴՆԹ-ի մաքուր պատրաստուկի ստացման ստանդարտ և արդեն դասական դարձած մեթոդը նկարագրվում է [[Դոյլ]]ի կողմից: կողմից։ Այն իրենից ներկայացնում է ԴՆԹ-ի անջատման CTAB մեթոդը:Դոյլիմեթոդը։Դոյլի մեթոդը փոքր [[մոդիֆիկացիա]]ներով կիրառվել է մեր կողմից:կողմից։
'''Ամպլիֆիկացիա և պրոդուկտների հայտնաբերում'''
Ամլիֆիկացիա իրականացնելու համար անհրաժեշտ է նախապատրաստել փոխազդող խառնուրդ և նրա մեջ ներառել ԴՆԹ-ի վերլուծվող նմուշը:նմուշը։ Ընդ որում, կարևոր է հաշվի առնել պայմանների շիկամշակման որոշ առանձնահատկություններ:առանձնահատկություններ։ Բանն այն է, որ որպես կանոն, վերլուծվող կենսաբանական նմուշում մասնակցում են (առկա) են ԴՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլներ, որոնց նկատմամբ ռեակցիայում օգտագործվող պայմանները ունեն մասնակի, իսկ որոշ դեպքերում զգալի համաբանություն ([[հոմոլոգիա]]):։ Բացի դրանից, պրայմերները կարող են միմյանց հետ [[թրծել|թրծվել]] առաջացնելով պրայմերներ-դիմերներ:դիմերներ։ Թե մեկը, թե մյուսը հանգեցնում են պրայմերների զգալի սպառման ռեակցիայի նյութերի երկրորդական (ոչ հատուկ) [[սինթեզ]]ի վրա, և որպես հետևանք, զգալիորեն պակասեցնում են համակարգի [[զգայունություն]]ը: Դա դժվարեցնում կամ անհնարին է դարձնում [[էլեկտրոֆորեզ]]ով իրականացված ռեակցիայի արդյունքների ընթերցումը:ընթերցումը։ Միջոցները, որոնք թույլ են տալիս զգալի չափով իրականացնել պրայմերների ոչ հատուկ շիկամշակումը:շիկամշակումը։
== Գրականություն ==
* Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. 226. pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. ISBN 1-59259-384-4. edit
* Bing, D. H., C. Boles, F. N. Rehman, M. Audeh, M. Belmarsh, B. Kelley, and C. P. Adams. (1996). "Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes". Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification.
* Cheghamirza K., Koveza O., Konovalov F. and Gostimsky S. ( 2002). “Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.)”. Cell. Mol. Biol. Lett. 7(2B):։ 649-655. pp.
* "Chemical Synthesis, Sequencing, and Amplification of DNA (class notes on MBB/BIO 343)". Arizona State University. Retrieved 2007-10-29.
* Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin и W.M. Gelbart. (1996). An introduction to genetic analysis (6th edn.).
* Kleppe, K. et al. (1971). [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283671904694 "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases". J. Mol. Biol. 56 (2): 341–361.]
* Stpeien L. J. et al. Appl. (2001).Genet. 40: 317-334. pp.
* Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507):։ 1304-51. PMID 11181995
== Արտաքին հղումներ ==
{{ՎՊԵ|Polymerase chain reaction}}
[[Կատեգորիա:Գենետիկա]]
| 